冰冻切片观察凋亡IFtunel+IF双标实验步骤-上海郑核

一、实验器材及试剂

1、实验器材

名称 厂家 型号

冰冻切片机 Thermo Cryotome E

载玻片 Servicebio

盖玻片 江苏世泰实验器材有限公司 10212432C

脱色摇床 Servicebio TSY-B

涡旋混合器 Servicebio MX-F

掌上离心机 Servicebio D1008E

移液枪 Dragon KE0003087/KA0056573

组化笔 Gene tech GT1001

冰箱 青岛海尔股份有限公司 BCD-192TGN

正置荧光显微镜 日本尼康 Nikon Eclipse C1

成像系统 日本尼康 Nikon DS-U3

2、主要实验试剂

试剂 厂家 货号

丙酮 国药集团化学试剂有限公司

PBS缓冲液 Servicebio G0002

蛋白酶K Servicebio G1205

破膜液 Servicebio G1204

BSA Servicebio G5001

Tunel试剂盒 Roche 11684817910

一抗

荧光二抗

DAPI Servicebio G1012

抗荧光淬灭封片剂 Servicebio G1401

二、冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤

1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液覆盖组织，37度温箱孵育25min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1 (TdT) 和试剂2(dUTP)按1:9混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。

5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。

6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）

7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。

8、DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。

9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

10、镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像。（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发红光）。

三．冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标结果判读

DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，Roche试剂盒为FITC荧光素标记，阳性凋亡细胞核为绿色，一抗标记的阳性细胞为红色

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